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リアルタイムPCRプロトコール（UPL (Universal Probe Library)）
ロシュUPL（Universal Probe Library）を用いたリアルタイムPCRの技術資料
1. 基礎知識：UPLとは？
Universal Probe Library(以下、UPL)は、ヒトをはじめ7種類の生物の、ほぼすべての遺伝子の発現定量が可能なプローブセットのことで、基本的にはTaqManプローブと同等のリアルタイムPCR用のプローブです。
ロシュからは生物種ごとに90種類のプローブをセットで、あるいはターゲット遺伝子の測定に必要なプローブのみを単品で購入することが可能ですが、研究基盤センターでは7つの生物種におけるすべての遺伝子を網羅したプローブセットを購入し、利用者の皆様に分注して提供しています。
UPLシステムを利用する際には、目的のプローブとそれに特異的なプライマー（利用者の皆様でご用意いただきます。脱塩グレードで全く問題ありません。）、それに加えてPCR酵素が必要となります。
ロシュによるUPLシステムの詳細は以下のリンクを参照してください。
Universal ProbeLibraryのウェブサイト（販売元：日本ジェネティクス）
2. 研究支援棟B(遺伝子実験施設）でのご利用
研究支援棟B(遺伝子実験施設）でUPLシステムをご利用いただくには、予約システムも含めた ViiA7 / LightCycler480 の利用のために、研究基盤センターに利用者登録をしていただきます。
必要に応じて、研究基盤センター機器運用・研究支援部門（米子）からUPLプローブ、プレートを購入することができます。
・ViiA7を使用する場合
| 品名 | 品名コード | 単位 | 価格 |
| 384穴プレート | i-r-005 | 1枚 | 1,100 |
| Optical Adhesive Covers（384穴プレート用） | i-r-006 | 1枚 | 320 |
| TaqMan Probe（2μM・60μl） | i-r-003 | 1本 | 1,600 |
・ LightCycler480を使用する場合
| 品名 | 品名コード | 単位 | 価格 |
| 96ウェルプレート+シール（LC480用） | i-r-007 | 1セット | 1,100 |
| シールのみ（LC480用） | i-r-008 | 1枚 | 260 |
| TaqMan Probe（2μM・60μl） | i-r-003 | 1本 | 1,600 |
予約システムの利用方法およびライトサイクラーの使用方法に関しては研究基盤センターHPをご覧ください。
・ViiA7使用方法
https://orip.tottori-u.ac.jp/setsubi/machine/id028436/
・LightCycler480使用方法
https://orip.tottori-u.ac.jp/setsubi/machine/id026717/
3. UPLプローブ用のプライマーの合成
UPLシステムでは、それぞれのプローブと遺伝子に対応したプライマーセットを見つけるためのサイト、UPL assay design Center にアクセスします。ここではそれぞれの遺伝子配列に対して最適のプローブとそのプライマーセットの組み合わせをオンラインで見つけることができます。
URL：https://qpcr.probefinder.com/organism.jsp
4.プロトコール
実際に研究基盤センターで使用している標準的なプロトコール（ViiA7）を紹介します。
■ FastStart Universal Probe Master 使用の場合
＜PCRミックスの調整＞
| Volume | |
| FastStart Universal Probe Master | 5 μl |
| UPL probe (2 μM) | 1.2 μl |
| Forward Primer (10μM) | 0.9 μl |
| Reverse Primer (10μM) | 0.9 μl |
| cDNA | 2 μl |
| Total Volume | 10 μl |
＜Cycling Program＞
| 95℃ | 10 分 | 1 cycle |
| 95℃ | 15 秒 | 40 cycles |
| 60℃ | 1 分 |
■ TaqMan Fast Advanced Master Mix 使用の場合
＜PCRミックスの調整＞
| Volume | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix (2×) | 5 μl |
| TaqMan Gene Expression Assay (20×) | 0.5 μl |
| DDW | 2.5 μl |
| cDNA | 2 μl |
| Total Volume | 10 μl |
＜Cycling Program＞
| 50℃ | 2 分 | 1 cycle |
| 95℃ | 30 秒 | 1 cycle |
| 95℃ | 15 秒 | 40 cycles |
| 60℃ | 1 分 |
5.データ解析に関する資料または関連リンク
・タカラバイオが提供する、一般的な原理の話等が盛り込まれたサイト
http://www.takara-bio.co.jp/prt/guide.htm
