RNeasy Mini kit を用いた付着培養細胞からの抽出方法

使用前にBuffer RLT 1mlに対して10μlのβ-メルカプトエタノールを加える。

細胞は1×107個以上使用しない。


  1. 培養液を捨てる
    2. RNeasy Mini kit1

  2. PBSで洗う
    3. RNeasy Mini kit2

  3. 350μl(細胞数<5×106の場合。5×106-107の場合600μl)のBuffer RLT を加えスクレーピング。
    4. RNeasy Mini kit3 RNeasy Mini kit4

  4. 21G針(1mlシリンジ)で10回程シェアリングし、20秒間ボルテックス。(→-80℃保存可)
    5. RNeasy Mini kit5 RNeasy Mini kit6 RNeasy Mini kit7

  5. 等量(350μl or 600μl)の70%エタノールを加える(沈殿ができても操作に影響しない)
    6. RNeasy Mini kit8

  6. ボルテックスし、700μlのサンプルを 2mlコレクションチューブのついたカラムにアプライする
    (沈殿がある場合にはそれを含む;カラムには700μlまでしか入らない)
    7. RNeasy Mini kit9 RNeasy Mini kit10

  7. 12000rpm、室温で15秒間遠心しフロースルーを捨てる
    (サンプルが700μl以上ある時は残りのサンプルを続けてアプライし、上記の条件で遠心する)
    8. RNeasy Mini kit11 RNeasy Mini kit12 RNeasy Mini kit13 RNeasy Mini kit14

  8. 350μlのBuffer RW1をカラムにアプライする
    9. RNeasy Mini kit15

  9. 12000rpm、室温で15秒間遠心しフロースルーを捨てる

  10. カラムに80μlのDNase溶液をアプライする
    (DNase溶液:10μlのDNase Iと70μlのBuffer RDDを混合)
    11. RNeasy Mini kit16

  11. 37℃、30分間インキュベートする
    12. RNeasy Mini kit17

  12. 350μlのBuffer RW1をカラムにアプライする

  13. 12000rpm、室温で15秒間遠心しカラムを新しい2mlコレクションチューブにのせる

  14. 500μl の Buffer RPEをカラムにアプライする
    15. RNeasy Mini kit18

  15. 12000rpm、室温で15秒間遠心しフロースルーを捨てる

  16. 500μl の Buffer RPEをカラムにアプライする

  17. 12000rpm、室温で2分間遠心しフロースルーを捨てる

  18. カラムを新しい1.5mlコレクションチューブにのせる

  19. 30μlのRNase-free waterを加える
    20. RNeasy Mini kit19

  20. 12000rpm、室温で1分間遠心し、カラムに30μlのRNase-free waterを加える

  21. 12000rpm、室温で1分間遠心する