PCR法

ポリメラーゼチェイン反応(PCR)法は微量のテンプレートDNAをもとに試験管内である特定の領域の塩基配列を酵素的に増幅する方法である。

PCR反応は、

• 94-95℃でテンプレートDNAを熱変性し一本鎖にする反応
• 温度を下げオリゴヌクレオチドプライマー*をテンプレートDNAにアニーリングさせる反応
• 温度を上昇させ耐熱性のDNAポリメラーゼでDNAを合成させる反応

の3段階からなる。
この3段階を25から40回繰り返すことにより、目的領域のDNAが増幅される。
DNAのみでなく、RNAからもリバーストランスクリプターゼを組み合わせることによりPCR法が可能である(RT-PCR)。

この方法は広く、遺伝子クローニング、病原ウイルスの検出、遺伝病の診断、病理の分野へ応用されている。
この方法は鋭敏であるのでDNAの混入には最大限の注意を払う必要がある。

今回はゲノムDNAを用いてsuperoxide dismutase遺伝子のエクソン部分の増幅を試みる。
PCR産物の確認は、500bp以下のものはポリアクリルアミドゲル電気泳動または、Nusieveを用いたアガロースゲル電気泳動で行う。

*オリゴヌクレオチドプライマー
一本鎖のDNAで、DNA合成機で作成する事が可能。PCR法では一般に20merから30mer程度の長さのものを使用する。

試薬

• ゲノムDNA(Mag Extractorで抽出したものを使用する)
• 滅菌蒸留水
• PCR用のバッファー(10X)　-　Taq DNA polymerase添付の物を使用する。
  • 100mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25 ℃)
  • 500mM KCl
  • 15mM MgCl₂
  • 0.01% gelatin
• 2mM dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP 各10 mMの溶液)
• Taq DNA polymerase (Ampli Taq Gold)
• オリゴヌクレオチドプライマー:(各10pmoles/μl)

操作

1. 1. PCR mix (solution)の作成　-　必要なサンプルの数の量を作成
      (サンプル数分をまとめて作成する、on iceで操作を行う)

(1サンプルあたり)
滅菌蒸留水	1.5μl
10×PCR buffer	2μl
2mM dNTPs	2.5μl
primerS (10pmoles/μl)	2μl
primerAS(10pmoles/μl)	2μl
Taq polymerase	0.1μl

1. 1. PCR用のチューブにPCR mixを10μlづつ分注する。(on ice)
   2. DNA溶液を10μl(0.1μg)づつ加える。(on ice)
   3. PCRの反応を行う。(オイルフリーの機械ではオイルは不要)